Nat Immunol：一种新型的小胶质细胞研究工具，为探索小胶质细胞开辟新途径

小胶质细胞和中枢神经系统（CNS）相关的巨噬细胞（CAMs），如血管周围和脑膜巨噬细胞，几乎与中枢神经系统的所有疾病相关。然而，由于缺乏合适的工具来区分在个体遗传学上密切相关的小胶质细胞和CAMs，人们对其细胞类型特异性的特征知之甚少。

为了建立一种新的小胶质细胞基因靶向模型，作者首先应用大规模平行单细胞分析比较了小胶质细胞和CAM在稳态和疾病过程中的特征，并发现己糖胺半乳糖苷酶亚基β（Hexb）可作为稳定表达的小胶质细胞核心基因，而其他小胶质细胞核心基因水平在病理过程中则表现出显著下调。接下来，作者构建了Hexb^tdTomato小鼠用于监测小胶质细胞在体内的状态，并证明了Hexb位点可被用于他莫昔芬（Tamoxifen）诱导Cre介导的小胶质细胞基因操作和小胶质细胞的谱系追踪，且可排除CAMs的影响。

总而言之，这篇文章提供了一种可用于特异性研究中枢神经系统中的小胶质细胞功能的新型工具。

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存在于CNS组织中的髓细胞是一类具有异质性的先天免疫细胞，对维持器官内稳态有着重要作用。其中，包括血管周围巨噬细胞（pvMΦ）和软脑膜下巨噬细胞（mMΦ）在内的实质性小胶质细胞和CAMs是中枢神经系统的主要器官特异性巨噬细胞，并在稳态和扰乱中起着基础性的作用。CNS中不同位置的CAMs和小胶质细胞具有不同功能：位于CNS界面的CAMs具有维护边界完整的作用，位于白质的实质性小胶质细胞对皮质神经元和少突胶质细胞起着支持的作用。

尽管小胶质细胞和CAMs的位置不同，但它们在健康的CNS中具有一些相同的谱系特征，包括起源、增殖过程以及髓细胞标志物的表达，如离子钙接头分子（Iba）-1， Cx3趋化因子受体1（Cx3cr1）、MER原癌基因酪氨酸蛋白激酶（MerTK）、CD11b和造血标志物CD45。单细胞转录组和蛋白质组分析结合成像技术已经揭示了实质性小胶质细胞和CAMs在稳态和扰乱中具有功能多样性。在CNS不同的分区中，实质性和非实质性巨噬细胞的定位不同，表明这些髓细胞亚型的功能并不完全相同，但由于缺乏细胞类型特异性的靶向工具，很难明确的界定CNS髓细胞的不同功能。

事实上，先前出现的Cx3cr1^Cre和Cx3cr1^CrERT2品系以所有CNS巨噬细胞为靶点，未能在基因水平上区分小胶质细胞和CAMs。因此，使用Cx3cr1^GFP、Cx3cr1^Cre或Cx3cr1^CrERT2品系的实验方法通常将CNS中所有巨噬细胞的混合体作为整体进行评估，而不是只针对小胶质细胞这一类进行研究。此外，现有的转基因品系如Sall1^GFP、Sall1^CreERT2、Cx3cr1^GFP、Cx3cr1^Cre或Cx3cr1^CreERT2通常是基于可能导致基因的单倍不足或功能性敲除的敲入策略产生的，因此可能影响小胶质细胞的表型。

因此，迫切需要新的基因工具来对正常生理环境中的实质性小胶质细胞进行研究。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和流式细胞术研究表明，小胶质细胞和CAMs具有明显的核心特征，包括Tmem119、Siglech、Slc2a5、P2ry12、Fcrls、SalI1、Hexb、Trem2等小胶质细胞表达特征，而CAMs的表达特征则是Lyve1、Cd163、Siglec1、Mrc1等基因的高表达。

这篇文章中，作者首先使用大规模平行单细胞测序对不同病理情况下的小胶质细胞关键特征进行全面研究，发现Hexb是一个可以稳定表达的小胶质细胞特征基因。然后，为观察及特异性定位小胶质细胞，作者应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了两种新的转基因小鼠模型，包括在内源性Hexb启动子的控制下，利用小胶质细胞的自我更新能力，产生tdTomato表达或他莫昔芬（TAM）诱导条件下Cre重组酶表达。这种品系模型可以为深入研究CNS发育、稳态和疾病过程中的小胶质细胞功能提供有价值的资源。

Hexb是稳定表达的小胶质细胞核心基因

对四种不同疾病条件下的小胶质细胞状态进行的单细胞分析结果显示，包括Tmem119、P2ry12、Sall1和Cx3cr1在内的大多数典型的小胶质细胞特征基因在一些神经退行性变和神经炎症状态均表现出表达水平降低的情况，Hexb在所有疾病模型中均可稳定表达，并且其表达高度局限于小胶质细胞内。

图1 对脱髓鞘化、髓鞘再生和FNX过程中的单细胞测序分析结果揭示了Hexb是一个稳定表达的小胶质细胞核心基因

图2 在稳态和自身免疫性神经炎症条件下，Hexb在小胶质细胞中稳定高表达，且在CAMs中不表达

Hexb^tdT品系小鼠可作为研究小胶质细胞在体活动的工具

作者通过CRISPR/Cas9技术插入T2A-tdTomato基因盒，使得Hexb和tdT的蛋白质表达过程受到内源性HexB基因座的控制，利用免疫荧光染色、免疫荧光成像、流式细胞术、三维重构等技术对8周龄及发育过程中Hexb^tdT/tdT小鼠脑组织中的tdT⁺细胞形态、Hexb基因在不同种类细胞中的表达情况等进行观察并做了定量分析。结果表明，Hexb^tdT品系模型可作为长时间或在疾病状态中跟踪小胶质细胞在体内活动状态的一种工具。

图3 Hexb^tdTomato模型鼠的构建与特征研究

图4 对神经退行性变和自身免疫性脱髓鞘过程中Hexb^tdT小胶质细胞的持续检测

图5 Hexb^tdT小胶质细胞在体动力学研究

构建可用于研究小胶质细胞功能的可诱导的Hexb^CreERT2系统

为利用Hexb增强子的活性对谱系特征、基因缺失影响进行研究，作者在Hexb基因座的终止子前插入了T2A-CreERT2基因盒（Hexb^CreERT2）。在这种情况下，Cre重组酶具有Hexb特异性，且需要雌激素拮抗剂TAM的存在才能激活。通过与Sall1^CreERT2、Cx3cr1^CreERT2模型对比、组织学检测等方法验证了流式细胞术的结果，表明这种TAM诱导的Hexb^CreERT2系可以在很长一段时间内对小胶质细胞产生高频、稳定的遗传修饰，并且对CAMs的影响很小。

图6 Hexb^CreERT2小鼠的构建及比较分析

细胞自主性祖细胞在小胶质细胞再增殖中的作用

为探究小胶质细胞与CAMs的再增殖过程是否来源于相同的祖细胞，作者利用BLZ945耗尽成年Hexb^{CreERT2/CreERT2}R26^yfp/yfp小鼠中所有CSF1R依赖的中枢神经系统巨噬细胞，并对其遗传谱系进行分析以研究它们的再增殖动力学。研究结果表明，在成年稳定状态下，中枢神经系统中不同的巨噬细胞（即小胶质细胞和边缘相关的CAMs），彼此独立存在，没有任何细胞水平的交换，在耗竭诱导的情况下，利用特异性的髓细胞介导再增殖。

图7 对CNS巨噬细胞清除后Hexb^{CreERT2/CreERT2}R26^yfp/yfp小鼠的遗传谱系分析

可对成年期的小胶质细胞功能进行研究

为了进一步评估Hexb^CreERT2系小鼠在研究成年期小胶质细胞功能中的应用，作者通过组织学和流式细胞术分析，分别在TAM注射一周及四周后，对成年Hexb^{CreERT2/CreERT2}R26^yfp/yfp、Hexb^{CreERT2/CreERT2}R26^tdT/tdT与Cx3cr1^CreERT2/+R26^yfp/yfp、Cx3cr1^CreERT2/+R26^tdT/tdT、Sall1^CreERT2/+R26^yfp/yfp型小鼠的重组效率和基因重组动力学进行了对比研究，并发现与Hexb^{CreERT2/CreERT2}R26^tdT/tdT小鼠相比，Hexb^{CreERT2/CreERT2}R26^yfp/yfp小鼠的小胶质细胞标记水平更高。

Hexb^{CreERT2/CreERT2}Csf1r^fl/fl小鼠中可产生对于小胶质细胞的选择性作用

由于CSF1R对所有CNS巨噬细胞的生存有着重要的作用，CSF1R缺失的小鼠中将缺少小胶质细胞和CAMs，作者构建了Hexb^{CreERT2/CreERT2}Csf1r^fl/fl小鼠以测试Hexb^CreERT2系的功能，并通过对脑组织进行病理学分析，研究了CSF1R缺失对于小胶质细胞的特异性影响。结果表明，可利用小胶质细胞特异性的CSF1R表达（由Hexb^CreERT2系统调节），在不影响CNS边界巨噬细胞数量的情况下分析CNS中实质性巨噬细胞的存活情况。

图8 Csf1r缺失对CAMs无影响，并对于小胶质细胞有特异性的影响

综上所述，可诱导的Hexb^CreERT2系利用了小胶质细胞独特的性质，包括Hexb的高度限制性表达，及其发育进程特征，使其区别于遗传特征相近的CNS髓细胞和外周血中的髓细胞。本文构建的体系是一个很好的体内模型，可以在特定的时间点对健康和疾病状态中的小胶质细胞特异性基因进行研究，为探索小胶质细胞开辟了新的途径。

参考文献：Masuda, T., Amann, L., Sankowski, R. et al. Novel Hexb-based tools for studying microglia in the CNS. Nat Immunol 21, 802–815 (2020). https://doi.org/10.1038/s41590-020-0707-4

作者信息

 

编译作者：Joanna（brainnews创作团队）

校审：Simon/Victoria（brainnews编辑部）

题图：sanzubusinesstraining.com

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